dr Takao Ishikawa

Część 2a
Oczyszczanie rekombinowanego białka 6✕His-SRSF1 z komórek bakterii Escherichia coli w warunkach denaturujących

Uwagi ogólne:
Wszystkie czynności należy wykonywać w temperaturze pokojowej.

Procedura wykonana przed ćwiczeniami:
Do komórek bakterii E. coli, szczep BL21DE wprowadzono plazmid pET28a niosący sekwencję nukleotydową kodującą białko SRSF1. Takie bakterie hodowano w podłożu płynnym w temp. 37℃ z wytrząsaniem. Gdy hodowla osiągnęła OD600=0,8 (gęstość optyczna mierzona spektrofotometrycznie przy długości fali 600 nm), pobrano część bakterii jako próbę nieindukowaną, a w pozostałej hodowli indukowano ekspresję SRSF1 przez dodanie IPTG (izopropylo-β-D-galaktopiranozyd) do ostatecznego stężenia 0,4 mM. Po 4 godz. ekspresji bakterie odwirowano i zamrożono.

Materiał biologiczny:
Osad bakterii E. coli wyrażających rekombinowane ludzkie białko SRSF1, zawieszony przed zajęciami w 5 ml PBS (50 mM fosforan sodu, pH 7,2; 150 mM NaCl) i poddany sonikacji (3 razy po 30 sekund przy amplitudzie 40%).

Odczynniki:
  1. ☺ Naważka imidazolu
  2. ☺ Bufor B:
    100 mM NaH    2PO4
    10 mM Tris-HCl, pH 8,0
    8 M mocznik
  3. Bufor B z 1 M imidazolem:
    rozpuścić otrzymaną od prowadzących naważkę imidazolu     [1] w odpowiedniej objętości buforu B [2]
  4. ☺ 50% zawiesina Ni-NTA-agarozy w buforze B (80 μl)
  5. Bufor do płukania:
    bufor B z 20 mM imidazol
    przygotować przez zmieszanie odpowiednich ilości buforu B     [2] i buforu B z 1 M imidazolem [3]
  6. Bufor do elucji:
    bufor B z 250 mM imidazolem
    przygotować przez zmieszanie odpowiednich ilości buforu B     [2] i buforu B z 1 M imidazolem [3]
  7. ☺ Bufor Laemmliego 5✕ (zob. Załącznik pkt 1.)
  8. ☺ Bufor PBS:
    50 mM fosforan sodu, pH 7,2
    150 mM NaCl
  9. ☺ Próbka B0 – osad bakterii E. coli niepoddanych indukcji, zawieszony w PBS homogenizowany metodą sonikacji.
  10. ☺︎ 100 mM PMSF w 96% etanolu


Wykonanie:

Uwaga!
Przed rozpoczęciem ćwiczenia proszę sprawdzić pH buforu B. W razie potrzeby doprowadzić pH do pożądanych wartości.

  1. Z zawiesiny E. coli pobrać próbkę 20 μl, przenieść do probówki podpisanej B1 i zachować do elektroforezy. Następnie zwirować bakterie przez 10 min. Supernatant odrzucić.
  2. Osad zawiesić w 2 ml buforu B [2], przenieść do probówek o pojemności 2 ml i inkubować z mieszaniem przez 40 min. Odwirować przez 10 min. Supernatant zebrać do nowej 2 ml probówki. Z supernatantu pobrać 20 μl, przenieść do probówki podpisanej B2 i zachować do elektroforezy.
  3. Supernatant przenieść do probówki z zawiesiną Ni-NTA-agarozy [4].
  4. Inkubować ze złożem przez 40 min. z mieszaniem, następnie odwirować przez 1 min. przy 2000 obr./min.
  5. Pipetą zebrać supernatant (białka niewiążące się do złoża) i odrzucić.
  6. Złoże przepłukać 3 razy po 1 ml buforu B [2]. Za każdym razem kilkakrotnie delikatnie wstrząsnąć probówką i wirować przez 1 min. przy 2000 obr./min. Następnie pipetą zebrać supernatant znad złoża i odrzucić.
  7. Złoże przepłukać 1 ml buforu do płukania [5]. Wirować j.w., pipetą zebrać supernatant i odrzucić.
  8. Białko eluować 4 porcjami po 80 μl buforu elucyjnego [6]. Wirować j.w. i zebrać frakcje elucyjne do nowych probówek. Z każdej frakcji elucyjnej pobrać po 5 μl, przenieść do jednej wspólnej probówki podpisanej B3 i zachować do elektroforezy.
  9. Następnie do probówek B1, B2 i B3 dodać po 5 μl buforu Laemmliego 5✕. Dodatkowo do elektroforezy przygotować próbkę kontrolną B0 [9] otrzymaną od prowadzących. Próbka zawiera 20 μl zawiesiny bakterii po sonikacji. Próbki do elektroforezy należy przechowywać w temperaturze -20℃.

Uwaga!
Jeśli po dodaniu buforu Laemmliego kolor roztworu zmieni się z fioletowego na pomarańczowy, należy dodać kroplę NaOH.

Część 2b
 Oczyszczanie rekombinowanego białka MBP-SRSF1 z komórek bakterii Escherichia coli w warunkach natywnych

Uwagi ogólne:
Wszystkie czynności należy wykonywać w lodzie. Bufory i wszystkie próby należy przechowywać w lodzie.
Do wszystkich buforów dodać bezpośrednio przed użyciem PMSF do stężenia 1 mM. PMSF dodawać tylko do takiej porcji buforu, jaka będzie wykorzystana danego dnia.

Procedura wykonana przed ćwiczeniami:
Dzień przed ćwiczeniami została założona hodowla bakterii E. coli ER2523 (NEB Express) stransformowana plazmidem pMAL-c5X-SRSF1 (cDNA kodujący białko SRSF1 połączony z wektorem pMAL-c5X) w pożywce LB z dodatkiem ampicyliny. Bakterie hodowano w temp. 37℃ z wytrząsaniem.

Materiał biologiczny: Nocna hodowla E. coli ER2523 (NEB Express) zawierających plazmid pMAL-c5X-SRSF1.

Odczynniki:
  1. ☺ Pożywka LB:
    0,5% ekstrakt drożdżowy
    1% trypton
    1% NaCl
  1. ☺ Stężony roztwór ampicyliny (1000✕)
  2. ☺ Sterylny 10% roztwór glukozy
  3. Pożywka LB z ampicyliną i glukozą:
    Dodać do 50 ml pożywki LB     [1] stężonego roztworu ampicyliny do stężenia 1✕ [2] oraz roztworu glukozy [3] do końcowego stężenia 0,2%
  4. ☺ 200 mM IPTG
  5. ☺ 1 M Tris-HCl, pH 7,5
  6. ☺ 5 M NaCl
  7. ☺ 0,5 M EDTA
  8. Bufor MBP:
    20 mM Tris-HCl, pH 7,5
    200 mM NaCl
    1 mM EDTA
  9. ☺ Złoże w formie kuleczek agarozowych z unieruchomionymi cząsteczkami amylozy jako 50% zawiesina w buforze MBP
  10. ☺ Naważki maltozy
  11. Bufor elucyjny:
    bufor MBP     [9] zawierający 10 mM maltozę (m.cz. 342 g/mol)
  12. ☺ Odczynnik Bradforda
  13. ☺ Bufor Laemmliego 5✕ (zob. Załącznik pkt 1.)
  14. ☺ 0,1% SDS
  15. ☺ 20% etanol
  16. ☺︎ 100 mM PMSF w 96% etanolu


Wykonanie:
  1. Zmierzyć wartość OD600 hodowli nocnej korzystając ze spektrofotometru. Hodowlę przed pomiarem należy rozcieńczyć 10✕ wodą. Optymalna objętość zawiesiny wprowadzanej do plastikowej kuwety wynosi 1 ml. Spektrofotometr należy poddać kalibracji wykorzystując wodę.
  2. Do 50 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę i glukozę [4] należy sterylnie wprowadzić taką objętość hodowli nocnej, by wartość OD600 w nowo zakładanej hodowli wynosiła 0,2.
  3. Hodowlę umieścić w inkubatorze w temp. 37℃ z wytrząsaniem. Wartość OD600 sprawdzać co ok. 30 min. (przy pomiarze nie jest konieczne rozcieńczanie hodowli) i doprowadzić do osiągnięcia wartości OD600 równej 0,5.
  4. Zachowując sterylność dodać IPTG [5] do końcowego stężenia 0,3 mM. Po 2 godz. hodowli w temp. 37℃ z wytrząsaniem przenieść hodowlę do probówek typu Falcon o pojemności 50 ml i zwirować (4000✕ g, 20 min.), supernatant dokładnie usunąć, a osad zawiesić 1 ml buforu MBP [9]. Zawiesinę bakterii zamrozić i zostawić do następnych zajęć.
  5. Rozmrozić zawiesinę bakterii i poddać sonikacji 6 razy po 15 sekund (15 sek. przerwy między pulsami sonikacji), pozostawiając probówkę cały czas w lodzie.
  6. W ten sposób uzyskany surowy lizat bakteryjny zwirować w mikrowirówce przy maksymalnych obrotach przez 10 min. Supernatant przenieść do nowej probówki typu Falcon, rozcieńczyć go 7 razy buforem MBP [9] i umieścić w lodzie. Pobrać 10 μl do nowej probówki typu Eppendorf, oznaczyć jako C1 i zachować do elektroforezy.
  7. Otrzymaną od prowadzących kolumnę przepłukać wodą, odkręcić kranik i upewnić się, że przepływ jest dobry. W razie kłopotów, skonsultować się z osobą prowadzącą zajęcia. Umocować kolumnę w statywie.
  8. Zamknąć kranik (zawsze przytrzymać kolumnę u wylotu drugą ręką, inaczej może pęknąć jej szklana rurka) i wprowadzić ok. 0,5 ml zawiesiny złoża [10]. Złoże przepłukać 5 ml buforu MBP [9]. Wypuścić bufor kolumnowy tak, by menisk był możliwie blisko powierzchni złoża i zamknąć kranik.
  9. Delikatnie wprowadzić roztwór zawierający białka z bakterii (pkt. 6) na złoże. Podstawić pod kranik probówkę typu Falcon.
  10. Otworzyć kranik i ustawić go tak, aby przepływ roztworu przez kolumnę był możliwie wolny.
  11. Gdy menisk zbliży się do powierzchni złoża, podstawić kolejną probówkę typu Falcon i wprowadzić do kolumny 1 ml buforu MBP [9].
  12. Gdy menisk zbliży się do powierzchni złoża, wprowadzić do kolumny 6 ml buforu MBP [9] i kontynuować płukanie złoża.
  13. Gdy menisk zbliży się do powierzchni złoża, zamknąć kranik i zatrzymać przepływ roztworu. Pod kolumnę wstawić statyw z 5 probówkami typu Eppendorf.
  14. Do kolumny wprowadzić 1 ml buforu elucyjnego [12] i odczekać 3 minuty.
  15. Otworzyć kranik i zebrać 5 frakcji po 0,5 ml (oznaczyć je jako C2-C6) uzupełniając bufor elucyjny w miarę jego ubywania.
  16. Ustalić frakcję najbogatszą w białko wykonując test Bradforda. Na arkusz parafilmu o wymiarach ok. 5 ✕ 10 cm nakroplić 6 porcji odczynnika Bradforda [13] o objętości 10 μl. Do pierwszej kropli dodać 10 μl buforu elucyjnego [12], a do kolejnych po 10 μl frakcji C2-C6. Po ok. 7 minutach porównać barwę kropli zawierających frakcje C2-C6 w stosunku do kontroli (z buforem elucyjnym) i wybrać frakcję o najintensywniejszym niebieskim zabarwieniu do dalszych prac.
  17. Z wybranej frakcji pobrać po 10 μl do dwóch nowych probówek i zachować do elektroforezy.
  18. Do trzech probówek zawierających próby do elektroforezy (pkt. 6 [C1] i pkt. 17 [wybrana próba]) dodać po 3 μl buforu Laemmliego [14].
  19. Przy użyciu spektrofotometru Nanodrop określić widmo absorpcyjne frakcji elucyjnej wybranej w wyniku testu Bradforda.
  20. Przeprowadzić regenerację złoża w następujący sposób:
    - przepłukać złoże 5 ml wody destylowanej
    - przepłukać złoże 5 ml 0,1% SDS     [15]
    - przepłukać złoże 1 ml wody destylowanej
    - przepłukać złoże 5 ml buforu MBP     [9]
  21. Zamknąć kranik i wprowadzić do kolumny 1 ml 20% etanolu [16]. Zawiesić złoże korzystając z pipety pasterowskiej i przenieść do probówki typu Falcon. Czynność powtórzyć 2 razy, aby większość złoża została przeniesiona z kolumny do probówki.


Część 2c

Rozdział elektroforetyczny uzyskanych preparatów białek SR

Materiały i odczynniki:

  1. ☺ Mieszanina prebarwionych białek wzorcowych (Załącznik pkt 1.)
  2. ☺ Roztwór do barwienia żelu błękitem brylantowym Coomassie R-250 (CBB
    R-250), do wielokrotnego użycia:
    0,2 % (w/v) CBB R-250 w roztworze woda:metanol:kwas octowy = 5:5:1
  3. 7,5% (v/v) kwas octowy
  4. ☺ Wzorzec wielkości 100 bp DNA Ladder Plus
  5. ☺ Roztwór bromku etydyny

Wykonanie:

  1. Przeprowadzić rozdział elektroforetyczny uzyskanych lizatów i frakcji elucyjnych z poprzednich części ćwiczenia (zob. Załącznik pkt 1.) w 12% żelu poliakrylamidowym. Nanieść próbki o obj. 10 μl w następującej kolejności:
    B0, B1, B2, B3, C1, wybrana próbka spośród C2-C6, wzorzec prebarwiony     [1], wzorzec wielkości DNA (5 μl) [4], wybrana próbka spośród C2-C6 o obj. 10 μl.
  2. Po przeprowadzeniu elektroforezy zdjąć szybkę bez wcięcia (z zaokrąglonymi rogami) i pozostawić żel na drugiej szybce z wcięciem.
  3. Korzystając z szarej przekładki, przeciąć żel między ścieżką zawierającą mieszaninę prebarwionych białek wzorcowych a ścieżką z wzorcem wielkości DNA. Krawędź przekładki należy przyłożyć do powierzchni żelu i wcisnąć ku szybce, na której leży żel. Nie należy jej przesuwać równolegle do powierzchni szybki, ponieważ może to spowodować poszarpanie żelu.
  4. Część żelu zawierającą mieszaninę prebarwionych białek wzorcowych umieścić w roztworze z barwnikiem [2] i barwić przez przynajmniej 20 minut.
  5. Drugą część żelu umieścić w roztworze z bromkiem etydyny [5] i barwić przez przynajmniej 10 minut. Następnie zarejestrować obraz przy użyciu transiluminatora UV.
  6. Żel z pkt. 4. przełożyć do 7,5% kwasu octowego [3], aby odpłukać nadmiar barwnika. W celu szybszego odbarwienia żelu odpłukiwanie barwnika w 7,5% kwasie octowym prowadzić na gorąco (w temp. ok. 60-80℃).

© 2015-2024 takao.pl