Materiał biologiczny
jedno jajo kurze klasy XL od kur z chowu ściółkowego lub z wolnego wybiegu

Odczynniki
  1. ☺︎ 1 M Tris-HCl, pH 8,0
    1. ☺︎ 5 M NaCl
    2. ☺︎ 0,2 M Na2CO3, pH 10,5
    3. ☺︎ 0,1 M KH2PO4
    4. ☺︎ 0,1 M K2HPO4
    5. ☺︎ 100 mM PMSF w 96% etanolu
    6. ☺︎ Blue Dextran 2000, 3 mg/ml
  2. Bufor kolumnowy, pH 8,2 (300 ml):
0,05 M Tris-HCl
0,05 M NaCl
 pH doprowadzić za pomocą HCl lub NaOH
 0,05 mM PMSF (dodać bezpośrednio przed użyciem odpowiednią ilość [6])
  1. Bufor fosforanowy pH 7,0 (ok. 100 ml):
Zmieszać ze sobą roztwory obu fosforanów potasu posiłkując się tabelą nad pehametrem w takich proporcjach, żeby końcowe pH wynosiło 7,0. Do fosforanu dwuzasadowego zanurzyć elektrodę i dodawać jednozasadowego do momentu uzyskania właściwego pH.
  1. Roztwór do elucji, pH 10,5 (10 ml):
0,2 M Na2CO3 [3]
 0,05 mM PMSF (dodać bezpośrednio przed użyciem odpowiednią ilość [6])
  1. ☺︎ Bufor do kolumny ENrich SEC 70, pH 8,2 (100 ml):
0,05 M Tris-HCl
0,1 M NaCl
 pH doprowadzone za pomocą HCl
roztwór filtrowany przez filtr o średnicy porów 0,22 μm
roztwór odgazowany przez sterylizację w autoklawie
  1. Złoża:
  • Sephadex G75 (dodać 1,5 g suchego Sephadex G75 do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml i zalać 45 ml buforu kolumnowego [8]) i pozostawić w temperaturze pokojowej – wszystkie pary
  • CM Sephadex C25 (dodać 0,25 g suchego CM Sephadex C25 do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml i zalać 45 ml buforu kolumnowego [8]) i pozostawić w lodówce – tylko wskazane pary
Uwaga:
Złoża należy przygotować na ćwiczeniach poprzedzających chromatografię i pozostawić do spęcznienia. Na następnych zajęciach należy ostrożnie zdekantować bufor znad złoża i dodać 40 ml buforu kolumnowego (o temp. pokojowej).

  1. ☺︎ Odczynnik Bradforda
  2. ☺︎ Kobalamina 1 mg/ml
  3. ☺︎ Preparat ścian komórkowych M. lysodeiktikus (naważka 30 mg)
  4. ☺︎ Bufor Laemmliego 5✕ (zob. Załącznik pkt 1.)
  5. ☺︎ Preparat białek wzorcowych BR

 Wykonanie

A. Przygotowanie materiału do izolacji – tzw. buforowanego białka
  1. Izolację rozpocząć od starannego oddzielenia białka od żółtka (zacząć od rozbicia skorupki). Jedno jajko może służyć jako materiał wyjściowy dla trzech par wykonujących ćwiczenie.
  2. Uzyskane białko jaja, wolne od jakichkolwiek domieszek żółtka, przefiltrować przez podwójnie złożoną gazę do zlewki o pojemności 100-200 ml (nie ściskać gazy). Do dalszej preparatyki potrzebne będzie 2 ml przefiltrowanego białka.
  3. Przenieść po 1 ml przefiltrowanego białka do dwóch probówek typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml i zwirować w mikrowirówce przez 5 min. przy maksymalnych obrotach.
  4. Delikatnie pobrać z jednej z probówek 0,5 ml klarownego supernatantu i przenieść do nowej probówki o pojemności 1,5 ml (druga probówka stanowiła równowagę podczas wirowania, dlatego można teraz ją wyrzucić). Dodać 0,5 ml buforu kolumnowego i delikatnie wymieszać. Oznaczyć jako BBP (buforowane białko do preparatyki).
  5. Przenieść 150 μl buforowanego białka do kolejnej probówki typu Eppendorf podpisanej jako BB0 i zamrozić. Próbka BB0 będzie potrzebna w częściach E i F tego ćwiczenia.
  6. Jeśli dalsze etapy ćwiczenia będą wykonywane innego dnia, próbkę BBP należy również zamrozić.

B. Przygotowanie kolumny ze złożem Sephadex G75 (wspólne dla obu wariantów ćwiczenia)
  1. Otrzymaną od prowadzących kolumnę przepłukać wodą, odkręcić kranik i upewnić się, że przepływ jest dobry. W razie kłopotów, skonsultować się z osobą prowadzącą zajęcia. Umocować kolumnę w statywie.
  2. Zamknąć kranik (zawsze przytrzymać kolumnę u wylotu drugą ręką, inaczej może pęknąć jej szklana rurka) i napełnić kolumnę buforem kolumnowym [8] do ¼ wysokości kolumny. Zawiesinę złoża Sephadex G75 wymieszać i nałożyć na kolumnę za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
  3. Odkręcić kranik i stopniowo dodawać zawiesiny złoża Sephadex G75, aż do wypełnienia kolumny zwartym złożem do wysokości czerwonego napisu Sigma. Zamknąć kranik. Dbać o to, aby zawsze był słup buforu nad złożem. Nie dopuścić do wyschnięcia złoża.
  4. Prawidłowe i jednolite ułożenie złoża jest kluczowe w chromatografii. Należy pilnować, żeby nie tworzyły się pęcherzyki powietrza w złożu. Prawidłowe działanie kolumny zostanie sprawdzone przez przepuszczenie roztworu Blue Dextran 2000 – niebiesko zabarwionego wielkocząsteczkowego polisacharydu opuszczającego kolumnę po usunięciu z niej roztworu o objętości równej objętości pustej kolumny. Związek nie mieszczący się w porach złoża do sączenia molekularnego zawsze będzie opuszczać kolumnę wcześniej niż jakiekolwiek białko penetrujące złoże.
  5. Odkręcić kranik i pozwolić, aby ciecz wsiąknęła w złoże. Zamknąć kranik.
  6. Przygotować 3 probówki typu Falcon o pojemności 15 ml ze skalą.
  7. Nawarstwić 100 μl roztworu Blue Dextran 2000 na powierzchnię złoża, następnie otworzyć kranik i pozwolić wsiąknąć w złoże. Nawarstwić 1 ml buforu kolumnowego, ponownie otworzyć kranik i pozwolić wsiąknąć w złoże. Następnie wolno wypełnić kolumnę buforem i dalej prowadzić chromatografię. Bezbarwny roztwór zbierać do pierwszej probówki. Gdy u wylotu kolumny pojawi się niebieski roztwór, zbierać go do drugiej probówki. Gdy roztwór opuszczający kolumnę stanie się znów przezroczysty, zacząć go zbierać do probówki trzeciej. Zakręcić kranik po zebraniu ok. 2 ml przezroczystego roztworu.
  8. Określić objętość pustą kolumny i rozcieńczenie Blue Dextran 2000. Kolumnę pozostawić pod słupem buforu.

C. Sączenie molekularne na złożu Sephadex G75
  1. Podpisać od 1 do 12 probówki do zbierania frakcji (probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml i wytłoczoną skalą) i umieścić je w statywie.
  2. Pod kolumnę podstawić zlewkę. Odkręcić kranik i pozwolić, aby ciecz prawie do końca wsiąkła w złoże. Zamknąć kranik. Usunąć zlewkę i podstawić statyw z probówką nr 1 pod wylot kolumny. Nawarstwić 0,5 ml buforowanego białka. Otworzyć kranik i pozwolić wsiąknąć w złoże. Zamknąć kranik. Nawarstwić 1 ml buforu kolumnowego. Otworzyć kranik. Kiedy w probówce nr 1 zbierze się 1 ml wycieku, przesunąć statyw, aby pod wylotem znalazła się probówka nr 2. Kiedy ta porcja buforu kolumnowego wsiąknie w złoże, delikatnie wypełnić kolumnę buforem kolumnowym i dalej prowadzić chromatografię, zbierając kolejne frakcje o objętości ok. 1 ml.
  3. W zebranych frakcjach oznaczyć obecność białka. Do 12 nowych probówek typu Eppendorf dodać po 80 μl odczynnika Bradforda [13], a następnie dodać do nich po 20 μl z każdej zebranej frakcji i zaobserwować zmianę zabarwienia po ok. 7 min. (białko powinno być obecne od frakcji nr 5).
  4. Ze względu na to, że w jajkach obficie występuje owoalbumina (ok. 43 kDa), białko to prawdopodobnie spowoduje intensywne zabarwienie próbki nr 5 lub 6 z odczynnikiem Bradforda. Lizozym o m.cz. 14,3 kDa prawdopodobnie powinien się znajdować we frakcji nr 7 lub 8, które pod wpływem odczynnika Bradforda zabarwią się mniej intensywnie. To te frakcje zostaną użyte do dalszego oczyszczania techniką sączenia molekularnego w systemie FPLC (wariant D1) lub metodą chromatografii jonowymiennej (wariant D2) w zależności od wariantu wykonywanego ćwiczenia.
  5. Z frakcji nr 7 i 8 przenieść po 150 μl do nowych probówek typu Eppendorf, podpisanych 7A i 8A, a następnie wszystkie 4 probówki zamrozić.

D1. Sączenie molekularne na kolumnie ENrich SEC 70 w systemie FPLC (wariant I ćwiczenia)
  1. Rozmrozić frakcję nr 7 lub 8 po sączeniu molekularnym na złożu Sephadex G75 (z pkt. C; wybrać tę o wyższym stężeniu białka) i przefiltrować za pomocą filtru strzykawkowego z membraną PVDF o średnicy porów 0,22 μm (Millipore) do nowej probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml.
  2. Do filtratu (ok. 600 μl) dodać roztworu kobalaminy [14] do końcowego stężenia ok. 20 μg/ml (roztwór stanie się lekko różowy).
  3. Podpisać od 1 do 25 probówki do zbierania frakcji (probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml z wytłoczoną skalą, którym obcięto wieczka) i umieścić je w odpowiedniej kolejności w statywie kolektora frakcji przy aparacie do FPLC.
  4. Do pętli iniekcyjnej aparatu do FPLC wstrzyknąć 500 μl tak przygotowanego roztworu.
  5. Rozdział wykonać przy użyciu buforu do kolumny ENrich SEC 70 [11].
  6. Uruchomić odpowiedni profil programu BioLogic Duo Flow – programu do obsługi aparatu do FPLC (włączony kolektor frakcji i spektrofotometr UV przy 280 nm, przepływ: 0,5 ml/min.; wstępne płukanie kolumny: 1 ml; ładowanie preparatu do kolumny: 0,5 ml; elucja: 20 ml.
  7. Po ok. 20 min. pojawi się sygnał od owoalbuminy (o masie 45 kDa).
  8. Sygnał od kobalaminy (o masie 1,35 kDa), po ok. 40 min., wskazuje koniec rozdziału chromatograficznego. Tuż przed nim powinien znajdować się sygnał od lizozymu (o masie 14,3 kDa). Otrzymany chromatogram porównać z chromatogramem wzorców.
  9. Uwaga! Ze względu na konstrukcję detektora (spektrofotometru UV), w trakcie rozdziału nie wyłączać światła w chłodni.
  10. Frakcje zawierające lizozym zamrozić.

D2. Chromatografia jonowymienna na złożu CM Sephadex C25 (wariant II ćwiczenia)
  1. Uzyskaną od prowadzących szklaną kolumnę przepłukać wodą, odkręcić kranik i upewnić się, że przepływ jest dobry. W razie kłopotów, skonsultować z osobą prowadzącą zajęcia. Umocować kolumnę w statywie.
  2. Zamknąć kranik (przytrzymując wylot kolumny drugą ręką) i napełnić kolumnę buforem kolumnowym [8] do ¼ wysokości. Zawiesinę złoża CM Sephadex C25 wymieszać i nałożyć na kolumnę za pomocą pipety Pasteura.
  3. Odkręcić kranik i stopniowo dodawać zawiesiny, aż do wypełnienia kolumny zwartym złożem do objętości 0,7 ml. Zamknąć kranik. Dbać o to, aby zawsze był słup buforu nad złożem. Nie dopuścić do wyschnięcia złoża.
  4. Podpisać od 1 do 16 probówki do zbierania frakcji (probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml i wytłoczoną skalą) i umieścić je w statywie.
  5. Odkręcić kranik i pozwolić, aby ciecz wsiąkła w złoże. Zamknąć kranik. Nawarstwić ok. 1,7 ml rozmrożonych i zmieszanych ze sobą frakcji nr 7 i 8 po sączeniu molekularnym na złożu Sephadex G75 (z pkt. C), następnie pozwolić wsiąknąć naniesionemu preparatowi w złoże. Nawarstwić 1 ml buforu kolumnowego, pozwolić wsiąknąć w złoże. Następnie, wolno wypełnić kolumnę buforem i dalej prowadzić chromatografię. Zebrać 8 frakcji o objętości 1 ml.
  6. Następnie przystąpić do elucji korzystając z roztworu do elucji [10]. Zebrać 8 frakcji elucyjnych po ok. 0,5 ml.
  7. W zebranych frakcjach elucyjnych oznaczyć obecność białka. Do 8 nowych probówek typu Eppendorf dodać po 80 μl odczynnika Bradforda [13], a następnie dodać do nich po 20 μl z każdej zebranej frakcji i zaobserwować zmianę zabarwienia po ok. 7 min.
  8. Zebrane frakcje elucyjne zamrozić.

E. Oznaczanie aktywności
  1. Rozmrozić wszystkie frakcje zamrożone wcześniej próbki.
  2. Przygotować zawiesinę substratu – jedną dla wszystkich grup pracujących danego dnia – 30 mg ścian komórkowych [15] zawiesić w 20 ml buforu fosforanowego [9] poprzez homogenizację w homogenizatorze Pottera. Przelać do zlewki i dopełnić tym buforem do 100 ml.
  3. Ustawić spektrofotometr na długość fali 450 nm. Wyjściową zawiesinę ścian komórkowych rozcieńczyć tak, aby odczyt OD (gęstości optycznej, ang. optical density) nie przekraczał 0,8. Niżej opisane reakcje prowadzić w tak przygotowanej zawiesinie. Reakcję prowadzić w temp. pokojowej dodając do kuwety spektrofotometrycznej 2 ml substratu i 100 μl badanej frakcji. Pomiar aktywności polega na obserwacji obniżenia zmętnienia substratu w czasie. Należy oznaczyć aktywność w buforowanym białku (próbka BB0), frakcjach 7A i 8A z sączenia molekularnego na złożu Sephadex G75, we frakcjach elucyjnych z FPLC, w których podejrzewamy obecność lizozymu, albo we frakcjach elucyjnych z chromatografii jonowymiennej na złożu CM Sephadex C25. Pomiar przeprowadzić w czasie 0 i po kolejnych minutach inkubacji, przez 5 minut. Sporządzić wykres przedstawiający zmiany absorbancji przy długości fali 450 nm dla wszystkich badanych frakcji.

F. Elektroforeza (wspólna dla obu wariantów ćwiczenia)
  1. Do przygotowania próbek na elektroforezę użyć 2 μl buforowanego białka (z próbki BB0), uzupełnionego wodą do 40 μl i po 40 μl frakcji elucyjnych. Wybór frakcji do naniesienia na elektroforezę skonsultować z prowadzącym. Próbki przygotowywać w probówkach typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Do wybranych próbek dodać 10 μl buforu Laemmliego 5✕ [16]. Podgrzać przez 3 min. w łaźni suchej o temp. 95℃. Gdyby elektroforeza miała być wykonana innego dnia, tak przygotowane próbki zamrozić.
  2. Przeprowadzić rozdział elektroforetyczny przygotowanych próbek w 12% żelu poliakrylamidowym zawierającym SDS (zob. Załącznik pkt 1.), nakładając po 25 μl każdej próbki i zachowując resztę zamrożoną na wypadek konieczności powtórzenia elektroforezy. Należy pamiętać także o nałożeniu na żel białek wzorcowych [17].
© 2015-2024 takao.pl