Materiał biologiczny: osad komórek HeLa S3 przepłukany buforem PBS i zamrożony

Uwaga!
Komórki HeLa należy traktować jak materiał biologiczny potencjalnie niebezpieczny. Należy pracować w rękawiczkach. Wszystkie naczynia mające kontakt z materiałem należy zalać po użyciu Domestosem, jednorazowe plastiki zgromadzić w koszu przeznaczonym do utylizacji.

Odczynniki:
1. ☺ Bufor P2: 3 mM MgCl2 1 mM EDTA 1 mM DTT 20 mM Tris-HCl, pH 7,8 1 mM PMSF
2. ☺ 10% Triton X-100 w buforze P2
3. ☺ Sacharoza in substantia
4. Bufor P2 / 0,88 M sacharoza: rozpuścić 3 g sacharozy [3] w 10 ml P2 [1]
5. ☺ 5 M NaCl
6. ☺ 1 M Tris-HCl, pH 7,5
7. ☺ 3 M KCl
8. ☺ 1 M MgCl2
9. ☺ 0,5 M EDTA
10. ☺ 14,3 M β-merkaptoetanol
11. ☺ 100 mM PMSF
12. ☺ bufor TAE
13. ☺ agaroza
14. ☺ preparat plazmidu pBR322 (50 ng/μl)
15. ☺ albumina (10 mg/ml)
16. ☺ bufor STOP: 27% sacharoza, 0,67% SDS, 67 mM EDTA, Orange G
17. ☺ roztwór bromku etydyny
18. Bufor relaksacyjny:
40 mM Tris-HCl, pH 7,5 [6] 120 mM KCl [7] 10 mM MgCl2 [8] 0,1 mM EDTA [9] 10 mM β-merkaptoetanol [10] 1 mM PMSF [11]

Uwaga!
Wszystkie czynności wykonywać w lodzie, używając schłodzonych probówek. Probówki szklane i gilzy należy dopasować wagą i schłodzić w lodówce. Następnie schłodzić wirówki Heraeus. Do buforu P2 dodać bezpośrednio przed użyciem PMSF do stężenia 1 mM.

Wykonanie:

A. Przygotowanie ekstraktu jądrowego komórek HeLa.

  1. Osad komórek HeLa zawiesić w 20 ml buforu P2 [1], dodać 100 μl roztworu Tritonu X-100 w P2 [2]. Przenieść do homogenizatora Pottera i homogenizować za pomocą 20 uderzeń tłoka teflonowego.
  2. Roztwór przenieść do szklanej probówki, podwarstwić 10 ml buforu P2/sacharoza [4] i wirować przez 20 min. przy 5 tys. obrotów w schłodzonej wirówce.
  3. Należy zaobserwować resztki niezlizowanych komórek na granicy faz bufor/sacharoza. Supernatant odrzucić, a osad jąder przepłukać pipetując 10 ml buforu P2.
  4. Odwirować przez 10 min. przy 5 tys. obrotów. Supernatant odrzucić.
  5. Osad zawiesić w 0,5 ml buforu P2, starannie zmierzyć objętość próbki i dodać NaCl [5] do stężenia 0,42 M. Ekstrakcję prowadzić przez 30 min. w lodzie z mieszaniem na kołysce. Po zakończeniu ekstrakcji całą zawartość probówki przenieść do nowej probówki Eppendorfa.
  6. Odwirować przy maksymalnych obrotach w schłodzonej wirówce na probówki Eppendorfa przez 10 min. Zebrać supernatant, który stanowi frakcję ekstraktu jądrowego. Zamrozić do następnych ćwiczeń.
  7. Przygotować bufor relaksacyjny [18] i schłodzić.

B. Oznaczanie aktywności topoizomerazy I:

  1. Pobrać 1 ml buforu relaksacyjnego [18], dodać albuminy [15] do stężenia 0,1 mg/ml.
  2. Do 6 probówek Eppendorfa oznaczonych R1-R6 przenieść po 5 μl plazmidu pBR322 [14]. Do próby stanowiącej kontrolę (R1) dodać 5 μl buforu relaksacyjnego z albuminą.
  3. W 5 nowych probówkach Eppendorfa (E2-E6) przygotować następujące rozcieńczenia ekstraktu jądrowego w buforze relaksacyjnym z albuminą: 20✕ (E2), 40✕ (E3), 80✕ (E4), 160✕ (E5), 320✕ (E6).
  4. Do probówek z plazmidem (R2-R6) dodawać po 5 μl każdego z rozcieńczeń ekstraktu jądrowego (E2-E6).
  5. Probówki zwirować przez 20 sek. i inkubować przez 30 min. w łaźni wodnej w 37℃. Następnie zwirować ponownie i dodać po 5 μl buforu STOP [16].
  6. Przeprowadzić rozdział elektroforetyczny próbek w 1,4% żelu agarozowym (zob. Załącznik pkt 2.), pozwalając wyjść barwnikowi poza żel. Po zakończeniu elektroforezy, DNA w żelu zabarwić w roztworze bromku etydyny [17], wykonać zdjęcie i ocenić aktywność enzymu.
© 2015-2024 takao.pl